Arbeitsblatt: PCR

Der Natur abgeschaut: Vermehrung der DNA im Labor: PCR Sie wissen nun, wie extrem fein und dünn die DNA ist. Genetische Analysen wären mit diesen winzigen mit Original-DNA Molekülen alleine nur sehr beschränkt möglich. Man benötigt dazu grössere DNA-Mengen. Heute kann man mit einem biochemischen Verfahren (PCR) gezielte DNA-Abschnitte vervielfältigen. Das Vorgehen wurde zu einem grossen Teil der Natur „abgeschaut. Was bedeutet PCR? polymerase chain reaction ( Polymerase-Kettenreaktion) Die PCR kann für eine Vielzahl von Experimenten und Analysen eingesetzt werden. Beispiele: • Vaterschaftstest (man sucht ganz bestimmte DNA Stücke STR mittels richtigem Primer, die sind unterschiedlich lang, Durch Gelelektrophorese unterschiedliche Banden • Die Erkennung von Erbkrankheiten (aufspüren von Mutationen, durch geeignete Primer ganz bestimmte Stücke suchen, ev sequenzieren) • Klonierung von Genen für Transfer (Gentechnologie) Routineuntersuchung von Blutkonserven (typische Virensequenzen suchen im Diagnostischen Fenster) • Nachweis von GVO Konsumentenschutz (typische Sequenzen suchen) Short tandem repeats (STR) (englisch, etwa kurze hintereinander auftretende Wiederholungen) bezeichnet in der Genetik die Wiederholung kurzer Basenpaar-Muster hintereinander in einem DNAoder RNA-Strang. Diese repetitiven DNA-Elemente werden auch als Mikrosatelliten bezeichnet. STR sind das zur Zeit gebräuchlichste DNA-Motiv, das für die genetische Individualisierung von Personen verwendet wird. Was macht man bei einer PCR? Mit DNA Polymerase einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs vervielfältigen. Die so vervielfältigte DNA kann nun für weitere Analysen verwendet werden Schematischer Ablauf einer PCR-Reaktion: Schema mit den SuS zeichnen. Aufgabe: Wie viele Kopien der Ursprungs-DNA sind nach 25 PCR-Zyklen vorhanden, wenn alles nach Plan abläuft und am Anfang der PCR die DNA aus einer Zelle vorhanden war? 225 225 33554432 (für das ganz korrekte Resultat müsste man die beiden Stränge vom Anfang noch abziehen, weil dies ja keine Kopien sind.also 225 Denaturierung Auftrennen der DNA erfolgt durch erhitzen„schmelzen PCR 2 -2 33554430) Für eine PCR braucht es relativ wenige „Zutaten: Ursprungs DNA, die vermehrt werden soll Primer (damit die DNA-Polymerase weiss, wo sie anfangen muss) DNA-Polymerase (damit der zweite Strang gebaut werden kann) Freie Nukleotide (damit die DNA-Polymerase Bausteine zur Verfügung hat) Thermocycler Wie „weiss die DNA-Polymerase, wo sie mit der Synthese beginnen muss? Man muss eine „Starthilfe beigeben, welche sich automatisch an den aufgespaltenen DNA Strang anlagert: Einen PRIMER. Freie Nukleotide lagern sich jewils ans 3 Ende an (Primer auch bei normaler Replikation, haben wir aber der Einfach heit halber weggelassen) Dies ist einkurzes bekanntes DNA-Stückchen, welches komplementär ist zu einem Teil der DNA (Länge ca. 2030 Nukleotide) Überlegen Sie: Warum braucht es jeweils zwei verschiedene Primer? Einen für den ersten Strang, eine für den zweiten Strang (Primer werden mittels software festgelegt, internationale Datenbanken) Was geschieht im Thermocycler? Es gibt bei der PCR drei verschiedene Temperaturstufen, die sich regelmässig abwechseln: 90o 70o 60o Trennen des DNA-Doppelstranges (Denaturierung) Ergänzung des Einzelstranges Anlagerung der Primer 90o Aufgabe: Zeichnen Sie die Temperaturkurve für 3 PCR-Zyklen ein. Überlegen Sie: Könnte die bei der PCR verwendete DNA-Polymerase eine menschliche DNAPolymerase sein? Wenn ja, warum? Wenn nein, warum nicht und woher könnte sie stammen? (hitzestabile tacpolymeraseaus dem Bakterium Thermophylus aquaticus, das in heissen Quellen bis fast 100 Grad lebt. Bei der PCR können nur kurze Bruchstücke vermehrt werden Es können nur Bruchstücke der DNA vermehrt werden und niemals die ganze DNA. Da es keine Reparaturmechanismen gibt, welche die DNA-Replikation überprüfen und reparieren könnten, gäbe es sehr viele falsche Kopien. In der Regel sind die Fragmente einige hundert bis wenige tausend Nukleotide lang. Ähnlich, wie bei einem Puzzle, kann man jedoch bei Bedarf die Informationen die man über einzelne Fragmente erhält, zusammensetzen. Der Natur abgeschaut: Vermehrung der DNA im Labor: PCR PCR 1 Sie wissen nun, wie extrem fein und dünn die DNA ist. Genetische Analysen wären mit diesen winzigen mit Original-DNA Molekülen alleine nur sehr beschränkt möglich. Man benötigt dazu grössere DNA-Mengen. Heute kann man mit einem biochemischen Verfahren (PCR) gezielte DNAAbschnitte vervielfältigen. Das Vorgehen wurde zu einem grossen Teil der Natur „abgeschaut. Was bedeutet PCR? polymerase chain reaction ( Polymerase-Kettenreaktion) Die PCR kann für eine Vielzahl von Experimenten und Analysen eingesetzt werden. Beispiele: • Vaterschaftstest (man sucht ganz bestimmte DNA Stücke STR mittels richtigem Primer, die sind unterschiedlich lang, Durch Gelelektrophorese unterschiedliche Banden • Die Erkennung von Erbkrankheiten (aufspüren von Mutationen, durch geeignete Primer ganz bestimmte Stücke suchen, ev sequenzieren) • Klonierung von Genen für Transfer (Gentechnologie) • Routineuntersuchung von Blutkonserven (typische Virensequenzen suchen im Diagnostischen Fenster) • Nachweis von GVO Konsumentenschutz (typische Sequenzen suchen) Was macht man bei einer PCR? Mit DNA Polymerase einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs vervielfältigen. Schematischer Ablauf einer PCR-Reaktion: Schema mit den SuS zeichnen. Die so vervielfältigte DNA kann nun für weitere Analysen verwendet werden Aufgabe: Wie viele Kopien der Ursprungs-DNA sind nach 25 PCR-Zyklen vorhanden, wenn alles nach Plan abläuft und am Anfang der PCR die DNA aus einer Zelle vorhanden war? 225 225 33554432 (für das ganz Denaturierung korrekte Resultat müsste man die beiden Stränge vom Anfang noch Auftrennen der DNA erfolgt abziehen, weil dies ja keine Kopien durch erhitzen„schmelzen sind.also 225-2 33554430) PCR 2 Für eine PCR braucht es relativ wenige „Zutaten: Ursprungs DNA, die vermehrt werden soll Primer (damit die DNA-Polymerase weiss, wo sie anfangen muss) DNA-Polymerase (damit der zweite Strang gebaut werden kann) Freie Nukleotide (damit die DNA-Polymerase Bausteine zur Verfügung hat) Thermocycler Wie „weiss die DNA-Polymerase, wo sie mit der Synthese beginnen muss? Man muss eine „Starthilfe beigeben, welche sich automatisch an den aufgespaltenen DNA Strang anlagert: Einen PRIMER. Freie Nukleotide lagern sich jewils ans 3 Ende an (Primer auch bei normaler Replikation, haben wir aber der Einfach heit halber weggelassen) Dies ist einkurzes bekanntes DNA-Stückchen, welches komplementär ist zu einem Teil der DNA (Länge ca. 2030 Nukleotide) Überlegen Sie: Warum braucht es jeweils zwei verschiedene Primer? Einen für den ersten Strang, eine für den zweiten Strang (Primer werden mittels Software festgelegt, internationale Datenbanken) Was geschieht im Thermocycler? Es gibt bei der PCR drei verschiedene Temperaturstufen, die sich regelmässig abwechseln: 90o 70o 60o 90o Trennen des DNA-Doppelstranges Ergänzung des Einzelstranges Anlagerung der Primer Aufgabe: Zeichnen Sie die Temperaturkurve für 3 PCR-Zyklen ein: Überlegen Sie: Könnte die bei der PCR verwendete DNA-Polymerase eine menschliche DNAPolymerase sein? Wenn ja, warum? Wenn nein, warum nicht und woher könnte sie stammen? (hitzestabile tacpolymeraseaus dem Bakterium Thermophylus aquaticus, das in heissen Quellen bis fast 100 Grad lebt. Bei der PCR können nur kurze Bruchstücke vermehrt werden Es können nur Bruchstücke der DNA vermehrt werden und niemals die ganze DNA. Da es keine Reparaturmechanismen gibt, welche die DNA-Replikation überprüfen und reparieren könnten, gäbe es sehr viele falsche Kopien. In der Regel sind die Fragmente einige hundert bis wenige tausend Nukleotide lang. Ähnlich, wie bei einem Puzzle, kann man jedoch bei Bedarf die Informationen die man über einzelne Fragmente erhält, zusammensetzen.